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中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

食品中雜色曲霉素的測(cè)定方法 GB 5009.25-85

Method for determination of sterigmatocystin in foods
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本標(biāo)準(zhǔn)適用于大輟⒂衩?、小麦、回毠及花傻雀鞣N食品中雜色曲霉素的測(cè)定。
1　原理
　　樣品中的雜色曲霉素經(jīng)提取、凈化、濃縮、薄層展開(kāi)后，用三氯化鋁顯色，再經(jīng)加
熱產(chǎn)生一種在紫外光下顯示黃色熒光的物質(zhì)，根據(jù)其在薄層上顯示的熒光最低檢出量來(lái)
測(cè)定樣品中雜色曲霉素的含量。
2　試劑　　　　　　　　
2.1 同GB 5009.22-85《食品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定方法》2.1～2.4。
2.2　冰乙酸。
2.3　甲酸。
2.4 95%乙酸。
2.5　4％氯化鈉溶液。
2.6 20％三氯化鋁-乙醇溶液:稱(chēng)取20g三氯化鋁(AlCl3?6H2O)溶于100ml乙醇中,過(guò)濾,室
溫看妗
2.7 雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液:用雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品配制成每毫升相當(dāng)于10μg的苯溶液。用
紫外分光光度計(jì)標(biāo)定其濃度(最大吸收峰的波長(zhǎng)325nm，分子量324, 摩爾消光系數(shù)15200),
并作硅膠薄層色譜純度鑒定，避光，放置于4℃冰箱中保存。
2.8　雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液：勘澆10μg/ml的雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成每毫升相當(dāng)
于1和0.4μg的雜色曲霉素溶液。避光, 放置于4℃冰箱中保存。
3　儀器
3.1 同GB 5009.22-85第3章。
3.2 玻璃板：10×10cm與10×18.5cm兩種。
3.3 展開(kāi)槽: 內(nèi)長(zhǎng)10cm、寬4.5cm、高17cm與內(nèi)長(zhǎng)11.5cm、寬60cm、19cm。
3.4　玻璃噴霧器。
3.5 空氣泵或油泵。
4　操作方法　　　　
4.1　提取
4.1.1 大米、玉米、小麥、黃豆及花生：稱(chēng)取20g過(guò)20目篩的大米、玉米、小麥及黃豆
樣品(花生樣品過(guò)10目篩孔)，置于具塞錐形瓶中，加80ml體積比為90:10的甲醇-4％氯
化鈉水溶液，振蕩30min, 過(guò)濾。收集樣液40ml(黃豆、花生樣品則取20ml，加入20ml提
取劑)，移入250ml分液漏斗中，再加入25ml4％氯化鈉溶液(使甲醇與水之體積比為55:45)
和25ml石油醚，振搖2min, 靜置分層。上層石油醚溶液置錐形瓶中, 下層溶液仍移入原
分液漏斗中, 再用25ml苡兔煙崛∫淮巍Ｗ詈蠼兩次上層的石油醚溶液合并，加入25ml
體積比為55：45的甲醇-4％氯化鈉溶液，振搖30s(黃豆、花生樣品則加入25ml體積比為
70：30甲醇-4％氯化鈉溶液，振搖30s)，將下層并于原甲醇水層中，重復(fù)用55:45甲醇-
4％氯化鈉溶液提取兩次(黃豆、花生樣品芨從70:30的甲醇-4％氯化鈉溶液提取一次)，
以提取該層的雜色曲霉素。下層溶液合并后加30ml三氯甲烷(黃豆、花生樣品除加三氯甲
烷外，再加13ml4％氯化鈉溶液，使甲醇與水的體積比為55:45)，振搖2min，靜置。待上
層混濁液有部分澄清時(shí)，即可將下層溶液經(jīng)放有約10g無(wú)水硫酸鈉的定量慢速濾紙過(guò)濾于
蒸發(fā)皿中。于分液漏斗中再加10ml三氯甲烷，重復(fù)提取一次,將該下層溶液和用少量三氯
甲烷洗濾器的洗液一并放入蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放置于65℃水浴上揮干，然后再在冰浴
上放置2～3min，加1.0ml苯將殘留物充分混勻，置入小試管中?；?qū)⒁陨险舭l(fā)皿中殘留
物用三氯甲烷移于濃縮管中，于65℃用減壓吹氣法濃縮至干，加入1.0ml苯，供色譜測(cè)
定，此1ml大米、玉米及小麥樣液各相當(dāng)于10g樣品，1ml黃豆與花生樣液則各相當(dāng)于5g
樣品。
4.2　測(cè)定
4.2.1　薄層板的制備：制備方法同GB 5009.22-85中4.3.1.1，園閿5g硅膠G可制成
10×10cm，厚度0.3mm的薄層板五塊。
4.2.2 點(diǎn)樣：取兩塊10×10cm薄層板，在距板下端各0.8～1cm基線上滴加標(biāo)準(zhǔn)使用液
與樣液如下: 距左邊緣0.8～1cm處各滴加10μl 0.4μg/ml標(biāo)準(zhǔn)使用液，在距左邊緣4cm
處各滴加80μl樣液(黃豆、花生樣品為40μl)，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)加滴10μl 0.4
μg/ml標(biāo)準(zhǔn)使用液，在滴加樣液時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)邊吹邊加。
4.2.3 展開(kāi)
4.2.3.1 橫向展開(kāi)：展開(kāi)劑是乙醚－正己烷―苯-三氯甲烷―甲酸(3:9:1.5:1.5:0.6) 
15.6ml(由于此混合液不成一相，每一展開(kāi)槽的用量須單獨(dú)配制)l用前充分搖勻，一并
倒入槽內(nèi)使用。將靠近標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的一邊，放入槽內(nèi)展至9cm左右取出揮干。
4.2.3.2 縱向展開(kāi)：展開(kāi)劑為苯-甲醇―冰乙酸(90:8:2或92.5:6:1.5)15ml。將靠
近標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液點(diǎn)的一邊放入槽內(nèi)，展開(kāi)9cm左右取出揮干。
4.2.4　顯熒光：在薄層板上噴20％三l化鋁―乙醇溶液，置80℃，加熱10min，立即
在紫外光燈(波長(zhǎng)365nm)下觀察結(jié)果，待薄層板冷卻后再薄薄的噴第二次(不需加熱)，
可直接觀察結(jié)果。
4.2.5 觀察與評(píng)定結(jié)果：在紫外光燈下觀察，若第二板的第二點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出
現(xiàn)最低檢出量，而在第一板的相同位置l未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則樣品中雜色曲霉素含量在
5μg/kg以下(黃豆、花生樣品為20μg/kg以下);若出現(xiàn)熒光點(diǎn)的強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低
檢出量的熒光強(qiáng)度相等，而且此熒光點(diǎn)又同第二板樣液的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相重疊，則樣品中雜
色曲霉素含量為5μg/kg(黃豆、花生樣品為20μg/kg); 若出現(xiàn)熒光強(qiáng)度比標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最
低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其熒光強(qiáng)度估計(jì)減少滴加微升數(shù)，或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌?BR>升數(shù)，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。在噴三氯化鋁第一、
二次后分別進(jìn)行觀察評(píng)定，兩次結(jié)果應(yīng)一致。若結(jié)果為陽(yáng)性，則將薄層板放暗處10min,
再觀察一次,如樣品仍為陽(yáng)性,進(jìn)一步作確證試驗(yàn)即在距薄層板(10×18.5cm)下端3cm的
基線上滴加一個(gè)點(diǎn)的10μl0.4μg/ml標(biāo)準(zhǔn)使用液與3個(gè)點(diǎn)的樣液，每點(diǎn)16μl。在樣液
的一個(gè)點(diǎn)上再加滴10μl0.4μg/ml標(biāo)準(zhǔn)使用液，另一點(diǎn)上再加滴10μl1μg/ml標(biāo)準(zhǔn)使
用液。于各點(diǎn)上n加一小滴三氟乙酸，放暗處反應(yīng)10min，熱風(fēng)吹5min，使薄層板上的
溫度不高于40℃，用冰乙酸-苯(10：90)展開(kāi)1～2次,直至雜色曲霉素衍生物與雜質(zhì)分開(kāi)
為止。展開(kāi)時(shí)要避光，以下顯熒光步驟同4.2.4。最后將板在紫外光燈下觀察，如樣液
為陽(yáng)性，應(yīng)產(chǎn)生與雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)重n的衍生物。確證法的靈敏度：大米、玉米、小
麥為25μg/kg(黃豆、花生樣品為50μg/kg)。
4.2.6　計(jì)算
V1 × D 1000
X = 0.004 ×───── × ────
V2 m
式中：X──雜色曲霉素含量，μg/kg；
　　V1──樣液濃縮后體積，ml;
V2──出現(xiàn)最低熒光樣液的滴加體積, ml;
D──濃縮樣液的總稀釋倍數(shù);
m──濃縮樣液中所相當(dāng)?shù)臉悠焚|(zhì)量,g;
0.004──雜色曲霉素的最低檢出量,μg。

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附加說(shuō)明:
本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會(huì)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分委員會(huì)提出, 由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)
督檢驗(yàn)所歸口。
　　本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生研究所負(fù)責(zé)起草。